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細(xì)胞培養(yǎng)基的基本知識(shí)

更新時(shí)間:2016-05-20 點(diǎn)擊次數(shù):1696
細(xì)胞培養(yǎng)基的基本知識(shí)
培養(yǎng)細(xì)胞的*培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如MEM)和添加劑(如血清或無(wú)血清培養(yǎng)用的某些確定的激素及生長(zhǎng)因子)組成,培養(yǎng)基的配方一直在改進(jìn),其中包括抗生素和抗有絲分裂劑等等。
一、基礎(chǔ)培養(yǎng)基 絕大多數(shù)培養(yǎng)基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎(chǔ)上,添加了氨基酸、維生素和其它與血清中濃度相似的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。zui廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)基是Eearle`s MEM 的混合物,其中含有13種必須氨基酸、8種維生素。而Ham`s F12 也包括非必須氨基酸,維生素的范圍亦很廣,另外常規(guī)含有無(wú)機(jī)鹽和代謝添加劑(例如核苷酸)。MEM/F12 這兩種培養(yǎng)基各取1/2,形成神經(jīng)生物學(xué)zui通用的培養(yǎng)基。Dulbecco`s改良培養(yǎng)基——DMEM,現(xiàn)應(yīng)用于快速生長(zhǎng)的細(xì)胞,同MEM含有相同的營(yíng)養(yǎng)成分,但濃度高出2~4倍。選擇某種培養(yǎng)基,應(yīng)仔細(xì)了解成分表,應(yīng)知道大多數(shù)情形下培養(yǎng)基都有不足。例如,有些培養(yǎng)基在氨基酸中包括有谷氨酸,而這種培養(yǎng)基雖廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域,但它對(duì)某些對(duì)谷氨酸敏感的可能有細(xì)胞外毒性損傷的神經(jīng)元而言,則并非*選擇,特別是如果神經(jīng)元生長(zhǎng)在缺乏膠質(zhì)的環(huán)境中時(shí)。F12中含有硫酸亞鐵,據(jù)報(bào)道也有神經(jīng)毒效應(yīng)。
在所有這些培養(yǎng)基中,谷氨酸比其他氨基酸有更高的濃度,這是因?yàn)樗哂胁环€(wěn)定性以及在許多細(xì)胞培養(yǎng)中它常用作碳源。對(duì)于神經(jīng)元的培養(yǎng)常常在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸(若培養(yǎng)基中這兩種物質(zhì)缺乏時(shí))。MEM與F12均要用5%的CO2來(lái)平衡,DMEM含更高濃度的NaCO3,要用10%的CO2來(lái)平衡,當(dāng)然也可以在較低CO2濃度下使用。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成成分是建立在對(duì)不同細(xì)胞系生長(zhǎng)的研究之上的,但通常在原代培養(yǎng)中使用也能有比較令人滿意的結(jié)果。 原則上,HEPES作為緩沖劑可用來(lái)代替碳酸氫鹽,以解除需要高濃度CO2培養(yǎng)環(huán)境的限制。實(shí)際操作中并非如此簡(jiǎn)單。顯然,溶解的CO2與碳酸氫鹽對(duì)良好的細(xì)胞生長(zhǎng)是重要的。Leiboviz`s L15培養(yǎng)基可用來(lái)在大氣環(huán)境中令神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng),該培養(yǎng)基采用了與眾不同的BSS作基礎(chǔ),它含有高濃度的氨基酸來(lái)提高緩沖能力,培養(yǎng)基中使用半乳糖作碳源,以阻止培養(yǎng)基中乳酸形成,少量溶解的CO2由丙酮酸代謝產(chǎn)生。這一培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)是明顯的,特別是在保持較高CO2有困難時(shí),例如在長(zhǎng)時(shí)間的顯微操作及生理學(xué)研究中。L15培養(yǎng)基已用來(lái)成功的培養(yǎng)了外周神經(jīng)元,但尚未在CNS神經(jīng)元的發(fā)育研究中全面檢測(cè)過(guò)。
二、血清 細(xì)胞在單純的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不能存活,在特殊類型的細(xì)胞培養(yǎng)中必須提供某些痕量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生長(zhǎng)因子才能使細(xì)胞得以生長(zhǎng)并維持生長(zhǎng)狀態(tài)?;A(chǔ)培養(yǎng)基常常要添加血清,血清終濃度多為5~20%。特殊用途的血清來(lái)源須用經(jīng)驗(yàn)確定,廣泛應(yīng)用的血清種類有馬血清與胎牛血清。胎牛血清中富含有絲分裂因子,常選其作增殖細(xì)胞用的血清,也用于細(xì)胞系和原代培養(yǎng)。而馬血清常常用來(lái)作有絲分裂后的神經(jīng)元培養(yǎng)。然而,很多人也將胎牛血清用于神經(jīng)元培養(yǎng),也有人用馬血清來(lái)培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞。用大鼠進(jìn)行神經(jīng)元培養(yǎng)的某些研究者喜歡使用同型血清;人類的胎盤(pán)血清,亦曾用于神經(jīng)組織的器官類型的培養(yǎng),也用在一些特殊培養(yǎng)種類中。 血清的不同批號(hào)含有不同的成分,所以許多人發(fā)現(xiàn),應(yīng)該在使用前對(duì)血清進(jìn)行測(cè)試。大多數(shù)試劑商提供樣品,所滿意的批號(hào)即可選用,這樣可以一次得到足夠一年用量的血清,血清在使用前通常在56℃加熱30分鐘,這一過(guò)程稱為滅活。
三、無(wú)血清培養(yǎng)基 1979年神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)了一個(gè)重要進(jìn)展,用化學(xué)添加劑即可維持神經(jīng)細(xì)胞存活與生長(zhǎng)而不需要在培養(yǎng)基中添加血清。其工作基礎(chǔ)是用合適的激素、營(yíng)養(yǎng)物和促貼壁的物質(zhì)的組合置換培養(yǎng)基中的成分,zui后找到了適合大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的試劑配方,該配方稱為N2,專門(mén)用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng),zui早是用在B104大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)。它的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是1:1的DMEM與H12的混合液,添加了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、黃體酮、腐胺和硒。胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子對(duì)于大多數(shù)類型細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)有重要作用,硒是谷胱甘肽產(chǎn)生的合作因子,可能有助于過(guò)氧化物和超氧化物的水解,有報(bào)道說(shuō)還能防止細(xì)胞的光照損傷。隨后的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉(zhuǎn)鐵蛋白。 未料到的是上述配方構(gòu)成的培養(yǎng)基可以支持神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系快速增殖,隨后又發(fā)展了能支持原代培養(yǎng)的各種神經(jīng)元生長(zhǎng)的培養(yǎng)基,這種培養(yǎng)基在許多實(shí)驗(yàn)室里已取代了有血清培養(yǎng)。在某些培養(yǎng)方案中,細(xì)胞直接進(jìn)入無(wú)血清培養(yǎng),這樣的培養(yǎng)基可以消除來(lái)自血清的不均一性。更為重要的是,它們可用來(lái)檢測(cè)生長(zhǎng)因子以及其他促進(jìn)神經(jīng)元存活或生長(zhǎng)的因子,或者用來(lái)檢測(cè)那些可保護(hù)神經(jīng)元免遭環(huán)境毒物損傷的制劑。于神經(jīng)元的培養(yǎng)基在某些培養(yǎng)環(huán)境中還可以減低非神經(jīng)元細(xì)胞的增殖,故可使神經(jīng)元純化。 血清中含有的組分,例如血清蛋白,可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養(yǎng)基中。當(dāng)缺乏這些成分時(shí),如神經(jīng)元在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),特別容易為過(guò)氧化物及自由基傷害,這已被許多研究者注意到了。過(guò)氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養(yǎng)基中過(guò)氧化物和超氧化物的累積,有報(bào)道講可以促進(jìn)低密度培養(yǎng)細(xì)胞的存活。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活可為氧分壓的下降而促進(jìn)。因而,無(wú)血清培養(yǎng)基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如,維生素E和丙酮酸,可作為過(guò)氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養(yǎng)時(shí)變小,特別是神經(jīng)元與膠質(zhì)共培養(yǎng)時(shí),它們可以吸收和代謝神經(jīng)元毒性物質(zhì)如谷氨酸。 應(yīng)該注意,盡管無(wú)血清培養(yǎng)基是有化學(xué)限定性的,但在培養(yǎng)過(guò)程中它仍有變動(dòng),培養(yǎng)起始時(shí)可能有些物質(zhì)缺乏,而后細(xì)胞的產(chǎn)物可能積累,從而使培養(yǎng)基的成分改變。這其實(shí)是有另一方面的好處,即條件培養(yǎng)基(已培養(yǎng)過(guò)細(xì)胞的培養(yǎng)基)的形成,條件培養(yǎng)基常常用來(lái)增加神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育。

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