MSC人間充質(zhì)干細(xì)胞流式鑒定操作步驟

流程

準(zhǔn)備細(xì)胞——抗體染色——上機(jī)檢測

1、準(zhǔn)備細(xì)胞：取培養(yǎng)的細(xì)胞離心（300 g/5min），棄去上清, 加入一定量PBS洗滌一次，棄去上清，彈散細(xì)胞，細(xì)胞重懸到5×10⁶~10×10⁶之間。

2、MSC人間充質(zhì)干細(xì)胞流式鑒定配色方案：

取100 ml的細(xì)胞于EP管或流式管內(nèi)，分三管染色。

*管 陽性配色 Anti-human CD90 FITC, Anti human CD105 APC，Anti-human CD45 PE-Cy7各加5 ml。

第二管 陰性配色 Anti-human HLA-RA FITC, Anti-human CD34 PE-Cy7, Anti-human CD73 APC各加5 ml。

第三管同型對照 Mouse IgG1 K Isotype Control FITC 0.6 ml，Mouse IgG1 Isotype Control PE-Cy7 1.2 ml，Mouse IgG1 Isotype Control APC 1.2 ml。

配色依據(jù)：細(xì)胞治療協(xié)會間充質(zhì)和組織干細(xì)胞委員會2006年提出了MSC鑒定的zui低標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于細(xì)胞表型的要求是表達(dá)CD90， CD105和CD73不表達(dá)CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA-DR；陽性指標(biāo)都需要染色，陰性指標(biāo)一般選擇2-3個指標(biāo)，因?yàn)槭亲黾?xì)胞表型鑒定，所以要配齊同型對照。

3、加入相應(yīng)的抗體后混勻，建議彈管子，盡量不用槍頭直接吹打，室溫避光孵育15 min，染色過程中再混勻一次。

4、染色完成后加入1 ml的PBS洗滌細(xì)胞，離心300 g/5min。

5、棄去上清，彈散細(xì)胞，加入500 ml PBS重懸，上機(jī)檢測。

注意：1、同型對照是根據(jù)染色抗體的用量來計(jì)算的，所以每種同型對照可能加入量可能不一樣（具體可看后文同型對照章節(jié)的介紹）。

   2、先上機(jī)檢測同型對照管，各檢測通道以這一管的信號設(shè)為陰性，在上機(jī)檢測抗體染色管。

   3、zui后結(jié)果的顯示用峰圖來表示，每種抗體的檢測結(jié)果都與對應(yīng)的同型對照染色結(jié)果疊加展示（ overlay ）。

MSC人間充質(zhì)干細(xì)胞流式鑒定結(jié)果

注意：CD90表達(dá)量非常高，所以建議用FITC熒光染料，F(xiàn)ITC/PE-Cy7/APC這三種熒光染料之間幾乎沒有補(bǔ)償，所以這三種染料一起染色不需調(diào)節(jié)補(bǔ)償，如果是做臍帶干細(xì)胞的鑒定，CD105抗體選擇SN6克隆號，其他克隆號染色結(jié)果不好（某些克隆號染不上）。

MSC人間充質(zhì)干細(xì)胞流式配色抗體

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